近日，中国科学院大连化学物理研究所生物分离分析新材料与新技术研究组研究员叶明亮、研究员秦洪强团队与中科院上海药物所研究员黄蔚团队合作，提出并构建了O-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）糖肽的可逆酶促化学标记策略，并与亲水作用色谱富集方法相结合，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏度检测，为生物样品中蛋白质O-GlcNAc糖基化的高覆盖度检测提供了一种简便有效的手段。
O-GlcNAc修饰主要发生在丝氨酸或苏氨酸（Ser/Thr）的残基，是一种重要的蛋白质翻译后修饰（PTM），参与调控细胞代谢、信号转导、免疫应答等生理过程。由于O-GlcNAc的低丰度、高度动态变化性，极大地增加了富集与分析的难度。目前，现有的抗体等非共价作用富集策略存在亲和力低、富集效率低等问题；化学酶促标记法等富集策略虽然显著提高了糖肽富集的特异性，但是该策略引入大质量标签，降低了糖肽的鉴定效率。
基于可逆酶促化学标记策略的O-GlcNAc糖肽富集与检测
针对上述问题，合作团队发展了一种可逆标记的无损富集检测策略。在该策略中，科研人员首先利用糖苷内切酶突变体Endo-M N175Q的转糖酶连接活性，将N-糖链基团连接到O-GlcNAc糖单元，从而提高O-GlcNAc糖肽的亲水性；接着，基于延长糖链的亲水性，采用亲水作用色谱方法对O-GlcNAc标记糖肽进行富集；最后，利用野生型糖苷内切酶Endo-M/S的水解活性，将富集后糖肽中的标记糖链释放，实现O-GlcNAc糖肽的无痕富集，避免了标记糖链对O-GlcNAc糖肽鉴定效率的影响，以此实现了O-GlcNAc糖肽的无损富集与检测。
合作团队将该方法应用于HeLa细胞核蛋白质O-GlcNAc糖基化的分析，从1.1mg蛋白样品中共鉴定到1414处潜在O-GlcNAc糖基化位点，其中637处（约45%）未在人源O-GlcNAc糖基化数据库中收录（1985-2020年），丰富了O-GlcNAc糖蛋白组基础数据。本工作鉴定到的O-GlcNAc糖蛋白中，包括识别RNA上N6-甲基腺苷（m6A）的YTHDF1和YTHDF3蛋白，以及与之形成相互作用网络的另外13种蛋白，后者与剧烈条件下应激小体的形成密切相关，为应激小体形成与蛋白质O-GlcNAc之间的作用机制研究提供了新线索。
相关研究成果以“Endo-M Mediated Chemoenzymatic Approach Enables Reversible Glycopeptide Labeling for O-GlcNAcylation Analysis”为题，发表在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed.）上。该工作的共同第一作者是大连化物所博士研究生陈尧和中科院上海药物所唐峰博士。上述工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、大连化物所创新基金、中科院青促会基金等项目的资助。
